KROMATOGRAFI ELEKTROFORESIS

BAB 1

PENDAHULUAN

I.1  Latar Belakang

            Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peniliti yang berkaitan dengan genetika maupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekular ini telah dimulai pada akhir abad ke-19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang kimia dan biologi.

            Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19, setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini juga termasuk protein.

             Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Metode elektroforesis telah digunakan dan dikembangkan dalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya yang sangat sederhana dan sangat mudah. Didalam ilmu biologi maupun biologi molecular, metode elektroforesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik, dan genetic dari hewan ataupun tumbuhan.

I.2 Rumusan Masalah

                  Masalah yang akan dibahas pada makalah ini adalah sebagai berikut :

1. Apakah pengertian elektroforesis?

2. Bagaimana prinsip operasi elektroforesis?

3. Bagaimana cara kerja elektroforesis?

4. Apa saja jenis-jenis elektroforesis?

I.3 Tujuan

                        Tujuan dari makalah ini adalah sebagai berikut :

1. Mengetahui pengertian elektroforesis.

2. Mengetahui prinsip operasi elektroforesis.

3. Mengetahui cara kerja elektroforesis.

4. Mengetahui jenis-jenis elektroforesis.

BAB II

ISI

II.1 Pendahuluan

                 Pemerian terperinci kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorang ahli botani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa. Pada tahun 1906, dia mengumumkan pemerian pemisahan klorofil dan pigmen lainnya dalam suatu sari tanaman dengan menggunakan alat seperti ditunjukkan dalam lampiran .

Gambar Michael tswett

                 Larutan eter petroleum yang mengandung cuplikan diletakkan pada ujung atas tabung gelas sempit yang telah diisi dengan serbuk kalsium karbonat. Ketika kedalam kolom itu dituangi eter petroleum maka akan terlihat bahwa pigmen-pigmen itu terpisah dalam beberapa daerah. Setiap daerah berwarna itu diisolasi dan diidentifikasi senyawa penyusun nya. Adanya pita berwarna itu, maka dia mengusulkan nama “kromatografi” yang berasal dari bahasa Yunani “kromatos” yang berarti warna dan “graphos” yang berarti menulis.

                 Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tetap tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.

II.2 Macam-macam Kromatografi

                 Ada beberapa cara dalam mengelompokkan teknik kromatografi. Kebanyakan berdasarkan pada macam fasa yang digunakan (fasa gerak – fasa diam) dan cara pengelompokkan lainnya berdasarkan mekanisme yang membuat distribusi fasa, diantaranya adalah :

1.      Kromatografi cairan – padat atau Kromatografi serapan

           Ditemukan oleh Tswett dan dikenalkan kembali oleh Kuhn dan Lederer pada 1931, telah digunakan sangat luas untuk analisis organic dan biokimia. Pada umumnya sebagai isi kolom adalah silica gel atau alumina yang mempunyai angka banding luas permukaan terhadap volume sangat besar. Keterbatasan yang lebih nyata pada kenyataan bahwa koefisien distribusi untuk serapan kerap kali tergantung pada kadar total. Hal ini akan menyebabkan pemisahan tidak sempurna.

2.      Kromatografi cairan – cairan atau Kromatografi partisi

           Dikenalkan oleh Martin dan Synge pada 1941 dan kemudian mendapatkan hadiah Nobel untuk hal itu. Fasa diam terdiri dari lapisan tipis cairan  yang melapisi permukaan dari padatan inert yang berpori-pori.

3.      Kromatografi gas – padat

           Digunakan sebelum tahun 1800 untuk memurnikan gas. Pada waktu dulu teknik ini tidak berkembang karena keterbatasannya yang sama seperti halnya kromatografi cairan – padat, tetapi penelitian lebih lanjut dengan macam fasa padat baru memperluas penggunaan teknik ini.

4.      Kromatografi gas – cairan

           Metode pemisahan yang sangat efisien dan serba guna. Teknik ini telah menyebabkan revolusi dalam kimia organic sejak dikenalkan pertama kali oleh James dan Martin pada 1052. Hambatan yang paling utama adalah bahan cuplikan harus mempunyai tekanan uap paling tidak beberapa torr pada suhu kolom. Sistem ini sangat baik sehingga dapat dikatakan sebagai metode pilihan dalam kromatografi karena dapat memisahkan dengan cepat dan peka.

5.      Kromatografi kertas

           Merupakan kromatografi cairan – cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembap udara oleh kertas. Teknik ini sangat sederhana bila digunakan.

6.      Kromatografi lapis tipis

           Serupa dengan kromatografi kertas, kecuali kertas diganti dengan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silica gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi ini pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.

7.      Kromatografi penukar ion

           Merupakan bidang khusus kromatografi cairan – cairan. Seperti namanya, sistem ini khusus digunakan untuk spesies ion.

8.      Penyaringan gel

           Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran – molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya.

9.      Elektroforesis

           Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak.

II.3 Pengertian Elektroforesis

            Fenomena elektroforesis dapat diketahui jika suatu fase zat bermuatan dan diberi beda potensial, maka fase itu akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu ke arah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik.

            Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan komponen atau molekul yang bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel  bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (katode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode).

            Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan :

Fe = q.E

            Dimana F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

            Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan  jumlah pasangan basanya.

            Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan  bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu.

II.4 Prinsip Operasi Elektroforesis

            Elektroforesis merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi : memisahkan campuran bahan-bahan  berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis, pemisahan dilakukan berdasarkan adanya pergerakan komponen bermuatan positif (+) pada kutub negative (-) serta komponen bermuatan negative (-) pada kutub positif (+). Pergerakan yang terjadi disebut elektrokinetik. Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalah elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi.

            Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang  banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Banyak molekul  biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Dalam hal ini protein diberi muatan negatif. Sampel protein dimasukkan ke dalam slot atau sumuran pada ujung agar. Karena sampel ini memiliki berat, mereka akan turun ke dasar sumuran.

II.5 Cara Kerja Elektroforesis

            Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan  berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

            Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan pada kolom-kolom (disebut well atau "sumur") pada sisi elektroda negatif, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Ketika aliran listrik diberikan, maka terjadi pengaliran elektron, sehingga zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Kecepatan  pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA.

             Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Pada elektroforesis terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak. Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis.

            Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi 2, yaitu :

1.      Elektroforesis Planar

2.      Elektroforesis Kolom

           Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis melainkan “elektrokromatografi”. Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut disebut “efek joule” yang disebabkan karena adanya tumbukan partikel electron. Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara, yakni :

1.      Pendinginan

2.      Efek Konveksi

           Efek konvensi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang digunakan dibuat dari silica yang bermuatan netral atau negative. Bagian luar kapiler dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur.

II.6 Jenis-jenis elektroforesis

            Jenis elektroforesis antara lain, elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler.

II.6.1. Elektroforesis Kertas

               Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung  pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

               Teknik pemisahan DNA/RNA berawal dari sekelompok ilmuwan  biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme  pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′  -monoposfat dan 3′ -monoposfat . Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui  pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer ). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

               Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya  perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara ( intermediate ) dan hasil reaksi ( nukleosida 2′ -monoposfat  dan nukleosida 3′ -monoposfat ) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir  proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

II.6.2 Elektroforesis Gel

               Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih  besar seperti protein- protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

               Tahun 1955, Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam ( stationary  phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida ( PAGE =  Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses  polimerisasi akrilamida  dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dangan ukuran lebih besar.

                Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi yaitu memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel,  pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang  berbeda-beda. Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasarkan laju  perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.

               Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu sebagai berikut :

1.Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda   oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang  berukuran besar.

3.Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

              

               Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1.      Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2.      Konsentrasi gel semakin tinggi karena konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3.      Bentuk molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4.       Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.

5.      Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.

6.      Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.

7.      Larutan buffer, elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA.

               Marker  adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.  Marker  berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi.  Marker  DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis  berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang  bermigrasi.  Marker-marker  DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker   DNA adalah lambda  Hind III. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan DNA marker tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb.

              

               Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari:

1. Comb             : digunakan untuk membentuk well  pada gel agarosa.

2. Tray                : digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.

3. Chamber         : digunakan sebagai wadah gel agarosa.

4. Sumber listrik : digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.

               Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan  Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai  pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel.

               Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat di sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA  finger printing , mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau  penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam  populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan  perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA.

Gambar Prosedur Kerja Elektroforesis Gel

               Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan  poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

                Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium  bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di  bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

II.6.3 Elektroforesis Kapiler

               Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino,  protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler  berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. Untuk aplikasi dalam  berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik  bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.

               Karakteristik elektroforesis kapiler yaitu :

1. Menggunakan pipa kapiler pada pemisahan elektroforesis.

2. Memanfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi, lebih dari 5 V/cm.

3. Menggunakan detektor berteknologi modern, sebagaimana yang ada pada    kromatogram.

4. Efisiensinya kadangkala sama dengan kromatografi gas kapiler, namun juga bisa lebih besar.

5. Membutuhkan waktu beberapa menit untuk mengamati sampel.

6. Mudah diotomatiskan untuk menganalisis dalam segi kuantitatif, dan mudah digunakan.

7. Terbatas dalam mengkomsumsi atau melibatkan sejumlah reagent.

8. Metode ini lebih aplikatif untuk menyeleksi dalam ukuran luas, dibandingkan dengan teknik separasi lainnya.

               Dalam kromatografi modern, efisiensi (N) merupakan factor penentu keberhasilan pemisahan. Oleh karena keluaran elektroforesis kapiler menyerupai kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indicator efisiensi, semakin tajam suatu peak semakin efisiensi pemisahan  tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dinyatakan dalam formula berikut :

N =

               Dimana, µ_ef menyatakan mobilitas elektroforetik, µ_eo adalah mobilitas alektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang diberikan, dan D adalah koefisien difusi solute.

               Salah satu keuntungan utama dari CE adalah dibutuhkan peralatan yang sederhana. CE terdiri dari satu daya tegangan tinggi, penyangga reservoir, sebuah kapiler, dan sebuah detektor. Pengaturan dasar dapat diuraikan dengn  peningkatan fitur seperti sampel, peralatan injeksi ganda, mengontrol suhu kapiler, pengaturan penyediaan daya, detektor ganda, dan kumpulan fraksi.

               Berbagai model elektroforesis kapiler dapat dilakukan menggunakan instrumen CE. Dasar dari perbedaan model pemisahan dapat dikarenakan  bahwa elektroforesis kapiler telah dikembangkan dari suatu kombinasi elektroforesis dan teknik kromatografi. Istilah umumnya ini dapat dianggap sebagai pemisahan elektroforesis dari sejumlah senyawa di dalam tabung sempit. Walaupun sebagian besar aplikasi telah dilakukan menggunakan cairan sebagai media pemisah, teknik elektroforesis kapiler dimana kapiler berisi elektroforesis gel, lapisan kromatografi.

              

               Instrumentasi CE terdiri dari :

1.      Pipa kapiler

         Pipa kapiler bertindak sebagai kolom tempat proses pemisahan pengganti kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvensional. Pipa kapiler terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 µm dan panjang antara 50-100 cm. semakin kecil ukuran diameter pipa kapiler maka semakin besar harga N. Oleh karena itu, semakin besar diameter (>100) maka pemisahan semakin tidak efisien.

2.      Larutan buffer

         Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut tercelup dalam larutan buffer. Larutan buffer berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan arus listrik dan untuk pengontrol muatan molekul. Karena molekul dapat bermuatan positif, negative, atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dalam menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis, 

3.      Sumber arus searah

         Dalam elektoforesi konvesional dialirkan arus searah sekitar 100 volt tetapi dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertegangan sangat tinggi 10.000-30.000 volt. Oleh karena itu, ekperimen elektroforesis kapiler dapat dilakukan dalam beberapa menit sedangkan eksperimen elektroforesis konvensional dilakukan dalam waktu sehari.

4.      Detector

         Detector dapat diletakkan disalah satu ujung pipa kapiler yaitu dekat katoda. Berbagai detector telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain : spektrometri (seperti UV dan fluoresen) dan detector elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri).

               Contoh Aplikasi Elektroforesis :

1.      Pemisahan ion Li⁺ dan Na⁺

               Kedua kation ini, Li⁺ dan Na⁺ sama-sama memiliki muatan +1, namun memiliki ukuran berbeda. Ion Li⁺ memiliki ukuran yang lebih kecil dari Na⁺. Ion Li⁺ akan lebih tersolvasi dengan air sehingga akan mengikat banyak molekul air. Akibatnya mobilitas Li⁺ akan menjadi kecil dan ion Na⁺ akan lebih dahulu keluar dari kapiler.

2.       Pemisahan NO₂^- dan NO₃^- menggunakan EOF (Electro Osmotic Flow)

               HNO₃ merupakan asam kuat, dalam air akan terurai sempurna menjadi H⁺ dan NO₃^- , sedangkan HNO₂ merupakan asam lemah, dalam air akan terdisosiasi sebagian. Pada pH 7, HNO₂ akan terdisosiasi sebagian, menyisakan spesi HNO₂. Hal ini tidak baik untuk pemisahan karena tidak semua HNO₂  berada dalam spesi NO₂^-. Untuk melakukan pemisahan dengan baik, kita harus menggunakan pH yang tinggi sehingga kedua spesi tersebut dapat berada dalam bentuk anionnya. Namun ketika pH sudah diatur tinggi, hanya akan terbentuk satu puncak pada elektroforegram. Hal ini disebabkan karena kedua spesi akan menuju pada kutub yang sama. Pemisahan dapat tetap dilakukan dengan baik asalkan muatan detektor diatur menjadi positif dan muatan injektor diatur menjadi negatif.

             Sistem yang berdasarkan pada skema (a) hanya akan menghasilkan satu  puncak, artinya pemisahan tidak berlangsung dengan baik. Pada skema (b) akan muncul dua puncak, artinya pemisahan NO₃^- dan NO₂^- terjadi dengan  baik. Hal ini disebabkan karena nilai mobilitas elektroforetik (μep) NO₃^-  lebih kecil dibanding μep NO₂^- , akibatnya mobilitas total (μt) NO₂^- menjadi lebih  besar dari μt NO₃^- . Hal ini akan berakibat NO₂^- akan keluar terlebih dahulu dibanding NO₃^- .

            Untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :

a.    Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.

b.    Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

c.     Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

II.7 Medium Pendukung

                 Elektroforesis untuk makromolekuler memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu cairan dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relative stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi electron (elektro osmosis), atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.

II.7.1 Cellulose asetat

II.7.2 Larutan Buffer

                 Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :

1.      Komposisi

           Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.

2.      Konsentrasi

           Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa akan meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas jugs meningkat, biasanya dipilih konsentrasi sebesar 0,05 – 0,10 M.

3.      pH

           Tingkat ionisasi asam-asam organic akan bertambah apabila pH bertambah sebaliknya untuk basa-basa organic. Oleh sebab itu, tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH.

II.7.3 Medan Elektrik

                 Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium :

1.      Voltase

           Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.

2.      Aliran listrik

           Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.

3.      Tahanan

           Medium elektroforesa menimbulkan aliran ion sebandin dengan jenis medium, jenis buffer, dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

                

BAB III

PENUTUP

III.1 Kesimpulan

            Dari pembahasan materi yang telah dijabarkan, dapat ditarik beberapa kesimpulan, antara lain sebagai berikut:

1.   Elektroforesis merupakan teknik pemisahan komponen atau molekul  bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

2.   Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi, yaitu memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya.

3.   Jenis-jenis elektroforesis yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel dan elektroforesis kapiler.

4.   Elektroforesis dapat digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai  bidang.

III.2 Saran

1.      Seharusnya, sebelum membuat makalah tentang elektroforesis ini alangkah baiknya dipelajari atau dibahas terlebih dahulu didalam kelas. Sehingga dalam pembuatan makalah menjadi mudah karena sudah mengetahui dasar-dasar elektroforesis.